细胞大规模培养的类型和方法（9）

(三)悬浮培养

    悬浮培养就是培养装置在外力（振荡、旋转、搅拌）作用下使细胞在培养基中一直处于悬浮状态进行生长，在悬浮培养中对类淋巴细胞研究得最多。贴壁生长的肿瘤细胞需在悬浮培养中适应一段时间后才能在悬浮状态下增殖。悬浮培养的优点有：
  (1)可连续扩大生产量。
  (2)有利于细胞与培基中的营养物质和气体充分接触，而且易于控制培养条件(温度、pH、氧分压和CO₂等)。
  (3)培养条件稳定，趋于均一，便于进行定量研究。
  (4)易于在连续密闭的系统中进行，减少了操作步骤和污染的机会。
  (5)可以长期连续培养，既可节省人力，又使细胞能持续维持在对数生长期。
  (6)悬浮适应的原贴壁癌细胞仍能附壁生长。
  (7)悬浮培养的细胞仍保持原先对病毒的敏感性和生物学特性。

    由于悬浮培养优越性大而常被人采用：

 1、细胞对悬浮培养的适应

    悬浮培养对造血细胞、淋巴细胞、白血病细胞、类淋巴细胞是最适合的，细胞无需适应选择，即可大量生长繁殖，但对贴壁细胞，如人二倍体细胞株（WI-38、MRC-5）在悬浮培养中则全部不能生存，但由于生产的需要如病毒生产、疫苗生产只能在一些敏感的贴壁细胞中才能增殖，有许多产品必须在这些贴壁的细胞系中才能制造。由于不同的细胞系在悬浮培养中生长的难易程度不同，目前发现某些转化的或癌变的细胞系可以经悬浮培养的适应性选择，可在贴壁依赖的细胞中产生出悬浮细胞系。

  （1）选择法 这一方法是由Panl及Struthers首先用L929细胞诱导出LS细胞系或自HeLa细胞诱导出HeLa-S3克隆细胞系而被证实。此法是将贴壁细胞消化分散后，以较高密度接种（至少达2×10⁵/ml）进行悬浮培养，然后再回至静置贴壁培养，这个程序要重复很多次，经过一段时间后，其中有些细胞只能在瓶壁上停留而不贴壁和伸展呈园形，但仍可进行有丝分裂和繁殖，这种被诱导产生的能在静态悬浮液中生长和分裂的活细胞种群，是可以进行悬浮培养的。

  （2 ）适应法? 这一方法大致与选择方法相同。不同之处是在于对培养物施加选择压力，即将培养物保持在机械悬浮状态，此法有相当多的细胞系可成为非贴壁的细胞。Capstick等采用适应法使BHK21（幼地鼠肾）细胞在悬浮培养中获得成功。具体方法如下：

[悬浮培养适应法程序]：

  ①用胰蛋白酶（0.1%）和EDTA液(0.01%)分离单层细胞，制备悬浮细胞。
  ②在至少2～3个或更多的大型培养瓶中，加入确实无Ca++、Mg++的培养液。
  ③加入的细胞使之最终浓度至少达5×10⁵/ml，以最低搅拌速率开始搅拌，以保持细胞均匀地混合（如250r/min）。
  ④每隔24小时取样并进行活细胞计数。
  ⑤每3天从培养液中取出培养物，经离心（800 r/min ）后，调整活细胞浓度至少达2.5×10⁵/ml，重新悬浮培养，若细胞浓度不够，可把几个培养物合并，以保证细胞密度。
  ⑥如果在培养换液时发现有细胞贴壁，可以加胰蛋白酶(0.01%)-EDTA(0.01%)混合液，搅拌消化30分钟，离心回收分离细胞；若发现悬液中细胞结团较严重时，也可加入胰蛋白酶-EDTA混合液使之分散。这种处理在第一次和第二次换液时一般是必要的，但在此后就很少了。如果细胞悬浮培养时持久地结团，可在生长液中加入50μg/ml的胰蛋白酶或分散酶(Boehringer)。
  ⑦成功适应的标志是开始换液时细胞数量增加，后来在一定培养时间内可获一致的细胞产量，说明有一个恒定的生长率。
  ⑧在搅拌的悬浮培养中维持新建立的细胞株是必要的，因为在静止培养时，它们可以恢复贴壁依赖的性质，某些细胞有时可贴壁于表面，但不完全扩展，呈现连续生长分裂成为一个圆球形的细胞。