细胞大规模培养的类型和方法（6）

2.6.4 蛋白质作基质的微载体

    明胶微载体，用明胶水溶液与疏水性有机液体如矿物油，明胶混合即聚结成微珠，继用戊二醛交联，最后用NaBH4还原，即得到淡黄色明胶微载体。这种微载体，具有优良的表面性质和光学性质，比重略大于水，基质是非刚性，无毒，能与多种细胞自然配位结合。特别是培养上皮形态细胞，如用其他基质微载体，收获细胞非常困难，但用明胶微载体时，用胶原酶消化细胞-微载体，明胶即完全溶解于消化液中，游离细胞悬浮在液体上层，收获很容易，且活细胞收率可达98%。所以，明胶微载体，是培养贴壁依赖细胞的一种优良微载体。
Grachev用他合成的明胶微载体（命名为Cytolar）培养小鸡胚胎细胞、肾细胞和人胚胎二倍体成纤维形细胞，并与商品Cytodex 3进行培养对比。以培养人胚胎二倍体成纤维细胞为例，两种微载体细胞贴壁率相当，均为84%～90%。但明胶微载体接种细胞2～3小时后，细胞即开始在载体表面上扩展。5天后，细胞生长成密的单层，细胞形态仍保持成纤维形，而Cytodex 3微载体，在相同时期内，细胞没有在载体表面上形成单层，并有相当多的细胞变为多边形。
    Wissemann用他合成的明胶微载体培养小鼠成纤维细胞(L-929)、人宫颈癌细胞（HeLa）、猪睾丸细胞和人静脉内皮细胞。细胞在微载体上生长速率与组织培养瓶相当，培养后的细胞-微载体，用胶原酶溶液消化15～20分钟，明胶微珠即全部溶解。
Corning Glass Works新近修饰了明胶基质，合成新的明胶微载体，它能支持人成纤维细胞、MDCK、Vero、猪睾丸等细胞贴壁生长，培养后的细胞-微载体，用0.13%～0。2%胰蛋白酶或0.4%Dispase溶液消化12分钟，明胶珠即完全溶解。
    Kohem用化学方法修饰胶原微珠上的胺基或羟基基团，使其带正电或负电荷，用于培养乳腺细胞，能提高细胞的贴壁速度。
    明胶微载体、细胞贴壁，生长和收获都容易，它的缺点是能吸附或捕捉培养基中有效营养成分，特别是血清。

（5）塑料作基质的微载体

  ①聚苯乙烯微载体(Biosilon)

    用聚苯乙烯基质作动物细胞培养的载体，早已使用过，实验室常用的塑料组织培养盘或瓶的材质大部分是取苯乙烯，经表面处理和组织处理后，能使动物细胞优化生长。1976年，Maroundas用磺化聚苯乙烯在一价和二价金属溶液中贴壁培养细胞的工作中，总结出这样的结论：载体表面负电荷密度2～10×10¹⁴/cm²之间，有利于细胞扩展，对微载体基质的要求不一定有特殊的生化性质，但要有物理-化学极性，且是刚性至密结构，即可作为动物细胞贴壁培养的好载体。Maroundas这一结论，与一般概念恰恰相反，一般概念认为，绝大多数脊椎动物细胞带负电荷，贴壁生长的载体表面要求带有适量的正电荷。如此，由正负电荷的静电相吸作用，使细胞容易贴在载体表面上生长。1986年，Johonssen和Nielsen根据Maroundas的概念，开发了表面负电荷密度2～10×10¹⁴/cm²聚苯乙烯塑料微载体，并由A/S Nune Demark公司批量生产，商品名为Biosilon。合成的Biosilon微载体透明，表面光滑无微孔，折光率近于玻璃。一粒微珠相当于一微透镜，在显微镜下摄像考察，能得到周边无暗影的全像，但没有像Sephadex那样清晰。Biosilon微载体表面经处理后，能为动物细胞贴壁生长提供最优条件。它的最大优点，是不摄取培养基中营养成分和生长因子，特别是不吸附血清，因而能获得制备高强度生物制品的细胞，并能收获细胞特殊代谢产物。微载体灭菌一般是用γ射线辐照。Niolesen和Jobansson曾用Biosilon微载体培养L-929，原代小鸡胚和MRC-5细胞。当细胞与微珠相对速度为零时，细胞贴壁非常均匀，贴壁率比静态培养低些，但倍增速率却相当或高些。Davies采用这种微软体进行静态和固定床两种系统培养小牛动脉内皮细胞。在静态培养，当单位生长表面接种量为2.82×10³cells/cm²(相当于细胞/微珠=3.5)时，经11天培养，生长的细胞密度接近饱合密度为1.3×10⁵cells/cm²(相当于细胞/微珠=180)，收获的细胞数高于接种数近50倍。固定床灌注系培养与塑料瓶单层培养相比，经24小时培养，收获的细胞量约高30倍，活细胞收率达93%。用这种微载体接种细胞方法，可甩微珠-微珠间的细胞转移，即是使新的微珠与载有细胞的微载体直接接触，细胞即转移到新微珠表面上。
Biosilon虽有上述的某些优点，但也存在着一些缺点：

  1)与带适量正电荷微载体相比，贴壁速度慢，可能是由于负电荷相斥的原因，这与Maroundas概念相反。如在载体表面上涂一层血清，或预先用有血清的培养基培育微载体，都能提高细胞的贴壁速度。

  2)Biosilon微载体是刚性结构，在搅拌培养条件下，微珠与微珠间碰撞，容易损害细胞。

  3)与其它多孔性微载体相比。需要较高的搅拌转速，方能使微珠均匀地悬浮在培养基中。为克服这一缺点，可添加0.075%琼脂提高培养基粘度来阻止微珠沉降，或在接种24小时内，不加搅拌，直至细胞贴在微载体表面上后，采用特殊的低转速搅拌混合。
Biosilon微载体适应培养的细胞类型相当广泛，但对原代细胞如小鸡胚胎成纤维细胞，由于贴壁困难，故接种细胞损失量相当大，导致细胞产率低。培养具有上皮形态细胞与培养成纤维形细胞相比，前者生长情况比后者好。